Клонирование, экспрессия и очистка новой высокоактивной щелочной фосфатазы с детоксикацией липополисахарида

Авторы: Daichao Wu, Da Teng, Di Xi, Xiumin Wang, Xiaojie Wang, Ruoyu Mao, Yong Zhang, Hua Dai, Jianhua Wang.
Название: Rapid cloning, expression and purification of a novel high-activity alkaline phosphatase with detoxification of lipopolysaccharide
Год статьи: 2014
(rAP), rЩФ – рекомбинантная ЩФ
Актуальность: Липополисахарид (ЛПС) - это бактериальный эндотоксин, вызывающий токсемию. Его фактор вирулентности «дифосфориллипид А» может быть устранен щелочной фосфатазой (ЩФ). Новый ген ЩФ (без интронов) был клонирован из Saccharomyces boulardii ATCC MYA-796 с номером доступа r KF471017, а рекомбинантная ЩФ (rAP) была экспрессирована в виде растворимого белка в Pichia pastoris  X-33 с выходом 43,66  мг/кг по окончании 120  ч индукции в колбе-шейкере. После очистки с помощью афинной хроматографии (affinity-column chromatography) чистота rAP составила более 90%. Рекомбинантная щелочная фосфатаза (rAP) показала широкую активность дефосфорилирования по отношению к LPS в широком диапазоне pH (pH 2-10) in vitro и достигала пика при pH 4 в буфере Tris-HCl. После того, как LPS, дефосфорилированный rAP, вводили мышам внутрибрюшинно, сывороточный уровень фактора некроза опухоли (TNF) -α был значительно снижен по сравнению с таковым в группе LPS (p  0,01). Эти данные свидетельствуют о том, что rAP имеет большой потенциал для лечения заболеваний, вызванных LPS.
Содержание: ЛПС является основным патогенным компонентом клеточных стенок грамотрицательных бактерий

. Это распознается врожденной иммунной системой и запускает сигнальные каскады рецептора (TLR4) через последовательное связывание с его корецепторами, такими как LPS-связывающий белок (LBP), CD14 и MD-2; и усиливает провоспалительные цитокины. Это приводит к э токсемии и в дальнейшем вызывает системный воспалительный ответ, сепсис и множественные синдром органной дисфункции.
ЩФ представляет собой класс фосфаттрансфераз, которые дефосфорилируют ЛПС, АТФ и нуклеотиды. Он присутствует почти во всех живых микроорганизмах и состоит из четырех различных изоферментов, у млекопитающих, включая плацентарный, плацентарный, кишечный и тканеспецифические изоферменты. В прошлом ЩФ использовалася как индикатор для ранней диагностики желтухи, рахита и т. д. Многие недавние исследования показали, что ЩФ снижает прохождение бактерий через слизистые оболочки и увеличивает толерантность кишечника к бактериям. ЩФ также может лечить заболевания, вызванные ЛПС, такие как воспалительные заболевания кишечника, острое повреждение почек, вызванное сепсисом, некротический энтероколит новорожденных, хронический колит и вторичный перитонит, поскольку он снижает токсичность ЛПС, прерывая ЛПС-опосредованный сигнальный путь воспаления. Следовательно, получение эффективной и безопасной точки доступа является насущной необходимостью.
В этом исследовании новый ген ЩФ был клонирован из S. boulardii и затем гетерологично экспрессирован в P.pastoris X-33